Ligation high

 

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高効率な１液タイプのライゲーション試薬です。サンプルと混合するだけで便利です！

本試薬は、T4 DNA Ligaseをベースとしたプレミックスタイプの高効率ライゲーションキットです。ライゲーションに必要な、反応バッファー・rATP・DTTなどは全て試薬中に含まれています。凍結／融解に対する安定性や反応効率向上のために組成条件を至適化しており、そのまま何度も凍結融解してご使用いただけます。使用法は、DNAサンプル溶液の1/2〜同量のLigation highを加えるだけでT4 DNA Ligase単体で用いた場合よりも、良好な結果を得ることができます。

特長1　簡便
DNAサンプル溶液にLigation highを混合するだけで、すぐにライゲーションを行うことができます。HindIII切断末端では５分でライゲーション完了！（実施例3『反応時間の検討』ご参照）

特長2　高効率
T4 DNA Ligaseを単独で用いた場合に比べ、50倍以上の効率を得ることができます。

特長3　優れた安定性
50回の凍結／融解を行ってもライゲーション効率の低下は認められません。

1.塩濃度の影響
DNA溶液に含まれる塩（NaCl）の濃度がライゲーション効率に及ぼす影響を検討しました。
評価は、pBluescript^®ⅡをSacⅠで切断した断片（5ng）をNaCl濃度の違うTE Buffer 5μlに溶解し、DNA溶液中に含まれる塩成分がセルフライゲーションの効率にどれくらい影響するかを指標としました。方法としては、DNA断片溶液に等量又は半分量のLigation highに加え、16℃で30min.反応させた後、2μlを形質転換に用い、生じたコロニー数を計測しました。
その結果、NaCl濃度が高いほど、ライゲーション効率が下がることが示されました。
　よって、制限酵素のH Bufferなど、塩濃度が高いDNA溶液をライゲーションに使用する場合は、一度TE Buffer等に置換することをお薦めします。

2.PCR産物のTAクローニングにおける反応時間の影響
本キットを用いて、PCR産物をTベクターに挿入し、時間の影響を調べました。実験法としては、まず、λDNAの500bpをターゲットにrTaq DNA PolymeraseでPCRを行い、その反応液1μl (約6.4ng)と2μlのTベクター(50ng)を3μlのLigation highに加え、16℃にて各反応時間インキュベーションし、ライゲーション反応を行いました。その後、反応液2μlで大腸菌を形質転換し、プレート上に生じた白コロニー及び青コロニーの数を測定しました。
　その結果、反応時間が長いほど効率が増加し、16hr.で最高となることが分かりました。また、青コロニーの数は、2hr.以上では変化はありませんでしたが反応時間が長いほど白色コロニーの数が増加しています。よって、Ligation highを用いたPCR産物のTAクローニングにおいて、高い挿入率を得たい場合には2hr.以上、好ましくは16hr.以上反応させることをお薦めします。
※短時間でのTAクローニングをご希望の場合はLigation high Ver.2をお薦めします。

3.反応時間の検討
λ/HindⅢをインサートとして、Ligation highを用いて16℃にて各反応時間ライゲーションを行い、EtOH沈殿後、電気泳動を行いました。
　その結果、HindIII切断末端においては、約5min.でも充分ライゲーション反応が完了していることが明らかになりました。

 ＜ご注意＞
●Ligation highの沈殿について
本キット中に沈殿が見れれる場合がありますが、この沈殿は安定化剤として使用しているBSAが沈殿を形成したものです。ライゲーション効率には問題ありませんので、加温して溶かしたりせず*、そのまま使用してください。また、沈殿を均一になるまで、混和する必要もありません。沈殿を含まない部分を反応に用いていただいて結構です。
*加温されると酵素が失活する恐れがございます。ご注意下さい。

●形質転換への適応
ライゲーション反応後、サンプルをエレクトロポーレーションに使用する場合には、エタノール沈殿やキットによる脱塩操作が必要です。
塩化カルシウム法においても、ライゲーションに用いたDNAサンプルが高塩濃度のバッファーに溶解していた場合には、脱塩操作を行った方が良い結果を得ることができます。

＜ワンポイントアドバイス＞
●Ligation highの使用量
通常は15μlのDNAサンプルに対して同量を添加します。制限酵素で切断したサンプルをベクターにクローニングする場合など、サンプルDNAの純度が高い場合には、半分量でも充分な結果を得ることができます。TAクローニングや、アガロースゲルから切り出したサンプルなどの場合は等量加えることをお薦めします。

●反応温度／時間について
通常は、16℃、30〜60分間で良好な結果を得ることができます。TAクローニングの場合には、2時間以上、好ましくは１６時間以上ライゲーション反応を行った方が良い傾向にあります（実施例2参照）。また、効率が悪い場合にも時間を伸ばすと良い結果を得る場合があります。また、数時間の反応であれば室温での反応であっても効率に影響はそれほどないことが分かっています。


基本反応条件：
＜プラスミドへのライゲーション＞
DNAサンプル 15μl
  （DNA Fragment 20−400fmloes）
  （Plasmid  50−100fmoles）
Ligation high 15μl

16℃、30−60min.

＜ファージへのライゲーション＞
DNAサンプル 15μl
  （DNA Fragment 600ng）
  （Phage 750ng）
Ligation high 15μl

16℃、30−60min.

＜リンカーライゲーション＞
DNAサンプル 15μl
  （DNA Fragment 100−200fmloes）
  （Linker 20−100pmoles）
Ligation high 15μl

16℃、30−60min.

備  考：
二本鎖DNA
　1kb      1pmole＝660ng

1）Richard L. Hawkins et al.,Current Microbiol.,38:335−341（1999）

 
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