トラブルシューティング

（2）プライマー条件について
　10kb以上のターゲットのPCRを行う場合、プライマーの精製グレードが高い方が良好な増幅を示すことがKOD FXを用いた実験により明らかになっています。Long PCRを行う場合は、脱塩グレードではなく、カートリッジ精製グレード以上のプライマーを用いることをお薦めします。

（3）増幅困難なターゲットの増幅について
　GC含量の高いターゲットの増幅において、DMSO（ジメチルスルホキシド）を反応液に１〜5%(V/V)添加することで増幅が改善されることがあります。DMSOの正確性に対する影響をKOD -Plus-を用いて確認したところ、5%までの添加では正確性の低下はみられないことを確認しています。また、弊社のPCR酵素でGC含量の高いターゲットも含め増幅困難なターゲットの増幅に最も適した酵素はKOD FXです。

（4）RNAの持込について
　RT-PCRを行う際に、逆転写反応液を直接PCR反応溶液に添加して使用する場合がありますが、反応液を持ち込みすぎると、PCR効率が低下する場合があり注意が必要です。その大きな原因は、cDNA溶液に含まれる大量のRNAがＭgイオンをキレートしてしまうためであると考えられます。KOD -Plus- Ver.2やKOD FXなどでは、この現象を緩和する工夫が加えられていますが、PCRに持ち込む逆転写反応液の量は1/25以下、好ましくは1/50以下にする方が安定した増幅が得られやすくなります。また、植物サンプルなどのゲノムDNAには、抽出の方法によっては大量のRNAが混入することがあるようです。このような場合は、一度リボヌクレアーゼ処理を行うか、ゲノムDNAの添加量を減らすことによって、良好な結果が期待できます。図16は、ＰＣＲ反応液に故意にRNAを添加した場合の、ＰＣＲの阻害実験の結果を示しています。RNA添加の影響は、KOD -Plus- Ver.2では若干緩和される傾向にありますが、やはり高濃度のRNAが存在することにより増幅が阻害されています。KOD FXではこの阻害の影響が出にくいように、さらに改良が加えられています。