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下記の実施例を掲載したチラシ形式のPDFファイルはコチラ からダウンロードしていただけます。
『KOD FX』のその他実施例はコチラから |
| 実施例9：コロニーPCRによる酵母形質転換体の確認 |
先生方からいただきましたKOD FXの使用例を掲載いたしております。今回は酵母のコロニーダイレクトPCRでも『KOD FX』の効果が確認された実施例をいただきました。
【遺伝子名】
Xanthophyllomyces dendrorousからクローニングし、
Saccharomyces cerevisiae Y187にプラスミドの状態で導入した配列4種（A-D）
【サンプル】
上記配列を導入したS. cerevisiae Y187のコロニーをつまようじで少量とり、
Zymolyase溶液（Zymolyase 2.5 mg/ml、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5、
1.2 Mソルビトール）10 μlに懸濁し、37℃ 30分インキュベート。
PCR反応液を調製し、上記の液をtemplateとして1 μl加えた（total 20 μl）。
【ターゲット長】
約3000 bp
【プライマー条件】
Forward 22 mer 5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer 5’-aaattgagatggtgcacga-3’
【サイクル】
KOD-FX: 94℃ 4 min
（98℃ 10 sec,60℃ 30 sec, 68 ℃ 4 min )×30cycles
4℃ ∞
他社酵素：推奨条件(30cycles)
M: 1kb DNA Ladder
1〜9: A社酵素
1〜9: KOD FX
1: A配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
2: A配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
3: B配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
4: B配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
5: C配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
6: C配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
7: D配列をもつプラスミドを導入したコロニー1
8: D配列をもつプラスミドを導入したコロニー2
9: 酵母からキットで抽出・精製したB配列をもつプラスミド（ポジティブコントロール）
上記の実験で良好な結果が得られましたので、続いてコロニーダイレクト(Zymolyase処理なし)PCRを行なっていただけました。
| 『コロニーダイレクト(Zymolyase処理なし)バージョン』 |
【遺伝子名】
他種酵母のcDNAライブラリー
【サンプル】
上記cDNAライブラリーを導入したS. cerevisiae Y187を直接PCR反応液に懸濁した。
【ターゲット長】
約500〜4000 bp
【プライマー条件】
Forward 22 mer 5’-ctattcgatgatgaagataccc-3’
Reverse 19 mer 5’-aaattgagatggtgcacga-3’
【サイクル】
KOD-FX: 94℃ 4 min
（98℃ 10 sec,60℃ 30 sec, 68 ℃ 4 min )×30cycles
4℃ ∞
M: 1kb DNA Ladder
1〜21: KOD FX
【データご提供】
奈良先端科学技術大学院大学 細胞機能学講座
浮辺健先生、大津厳生先生、高木博史先生
【先生からのコメント】
以前から他社のポリメラーゼを用いて酵母のコロニーPCRを行っていたが、ちょっとした条件の違い
（コロニーの年齢、使用する菌体の量）などで増えたり、増えなかったりということが頻繁に起きていた。
このKOD FXを使ってすでに100回以上コロニーPCRを行ったが、今までに増幅に失敗したことはない。
さらに、酵母菌体をZymolyaseで処理せずに（大腸菌のコロニーPCRと同様に）、PCR溶液に直接菌体を加える方法でも問題なく増幅できる。
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