抗体アッセイ

Can Get Signal ユーザー様実施例1

実施例1 ウエスタンブロットによる新規癌遺伝子産物MM-1αの検出

先生方からいただきました実施例を掲載いたしております。実験にお役立てください。

【結果・コメント】
私の所属する研究室で同定された新規癌抑制遺伝子産物MM-1α/Prefoldin 5 の抗体を購入し、内在性またはリコンビナントのMM-1α をWestern blot において検出可能かどうかを確認していたところ、従来の抗体のPBS 希釈では細胞をサンプルとした場合の内在性のMM-1αのシグナルは全く検出されず、リコンビナントのMM-1αでもわずかにバンドが確認される程度でしたが、 Can Get Signal^®を用いた場合では明らかにシグナルの強度が増し、内在性のものでも十分にバンドが確認されるようになりました。　現在はブロッキングを十分に行うことで*、少量のタンパク質Lysate を泳動した場合においても十分なシグナルを検出することが出来ており、大変満足しています。他の抗体を使用する際にも、 Can Get Signal^®を用いることでシグナルが強くなるか否かを確認してから、実験を進めるようにしています。

【データご提供】
北海道大学生命科学院分子生物学分野

*ブロッキングの工夫
ブロッキングに関しては、用いる5% スキムミルクの液量を増加させ、振倒をより穏やかに長時間(2hr→4hr)行うように変更いたしました。また、TOYOBOのHPに記載されております『私にもできた！ライフサイエンス実験シリーズ　ウェスタンブロッティング・免疫染色編』（PDFファイル）を参考に、ブロッキング→抗体付加の間にTBS-T での十分な洗浄操作を加えるようにいたしました。それまでは、ブロッキング後にすぐCan Get Signal^®を用いておりましたが、洗浄を行うことでブロッキング液の持ち越しなしに抗原抗体反応を行えたのではないかと思っております。このようにHP を参考にさまざまな操作方法を変更したため、どの過程が効果的に作用したのかは定かではありませんが、良いMM-1αの抗体が無い中で検出方法を試行錯誤していたなか、HP に記載されている情報はとても有難いものでした。

【実験方法】
●サンプルの由来と調製法
MM-1α
【由来】HEK293T（培養細胞）
【調製法】HEK293T をRIPA buffer にて可溶化

GST-FLAG-MM-1α
【調製法】GST融合タンパク質として精製

●ブロッティング方法：ウェット法

●メンブレンのブロッキング　
1. ブロッキング溶液　：5% Skim Milk in PBS
2. インキュベート温度：室温
3. インキュベート時間： 2時間

●抗体反応　
＜一次抗体＞
   1. メーカー名：Abnova
   2. 商品名：PFDN5 polyclonal antibody
   3. 希釈倍率：1/1000
   4. 希釈溶液：5% Skim Milk in PBS or Can Get Signal^®Solution1
   5. インキュベート温度    ：室温
   6. インキュベート時間    ： 4時間

＜二次抗体＞
   1. メーカー名：Invitrogen
   2. 商品名：Alexa Fluor 680 donkey anti-rabbit IgG (H + L)
   3. 希釈倍率：1/6000
   4. 希釈溶液：5% Skim Milk in PBS or Can Get Signal^®Solution2
   5. インキュベート温度    ：室温
   6. インキュベート時間    ： 1時間

●シグナルの検出　
LI-COR 社Odyssey システムにより蛍光検出

【関連製品】Can Get Signal^®用ブロッキング剤好評発売中！
詳細はコチラから

製品詳細に戻る
ホームに戻る