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KOD FXは、クルードサンプルからの増幅効率に優れた高成功率PCR酵素です。以下に、先生方からいただきましたKOD FXの使用例を掲載いたしております。実験にお役立てください。
| 実施例15： マウス尾溶解液からのゲノムDNAの増幅 |
| ◆実験2. プラスミドサンプルを用いたPCR効率比較 |
【サンプル】
実験 1) mouse tail lysed with Proteinase K 0.5μl
実験 2) Plasmid (20ng)
【ターゲット】ターゲット遺伝子名、増幅サイズ
実験 1) pGKneo, 500 bp
実験 2) CAG promoter region + GFP, 3 kb
【プライマー配列】
実験 1) forward, reverse共に20 mer
実験 2) forward, 21 mer; reverse, 29 mer
【反応液組成】
●KOD FX
PCR grade water X μl
2x PCR buffer for KOD FX 7.5 μl
2mM dNTPs 3 μl
10pmol /μl Primer #1 0.45 μl
10pmol /μl Primer #2 0.45 μl
KOD FX (1.0U/μl) 0.3 μl
サンプル Y μl
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Total reaction volume 15 μl
※他社品は取説に従い調製を行いました。
【サイクル】
実験 1)
95℃ 2min
↓
(95℃ 30 sec, 56℃ 30 sec, 72℃ 30 sec) 36 cycles
↓
4 ℃, forever
実験 2)
95℃ 2 min
↓
(98℃ 10 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 3 min) 33 cycles
↓
4 ℃, forever
【データご提供】
高知大学医学部解剖学講座
三井 真一 先生
【先生からのコメント】
想像以上に増幅効率が高く、驚きました。
マウステールの処理ですが、以下のように行っています。3〜5 mmの長さに切ったマウステールに500 μLのLysis buffer (100 mM Tris-Cl, pH8.5, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.2% SDS, 100μg/ml Proteinase K)を加えて56℃で一晩混合する。この溶解液の0.5 μLをテンプレートとして反応液に加えています。Proteinase Kの失活操作はしていません。overnightで処理しているうちに自己分解して失活するようです。経験上、加える液量が過剰であったり、テールの溶解時間が短い（数時間程度；テールは一応溶解しています）とバンドの出方が悪い気がしています。
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