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コロニーダイレクトPCRプロトコール
※方法、PCRサイクル等の詳細はコチラからご覧いただけます。 |
一口メモ①混合型酵素について（図解入り説明はコチラから）
3'→5'Exonuclease活性（Proof-reading活性：DNAを3'側から分解してゆく活性）を有さない酵素に、Proof-reading活性を有するα型DNA polymeraseを微量混合することにより、PCRのパフォーマンスが格段に向上することが報告されています(参考文献：Barnes W.M. PNAS 91: 2216 (1994)）)。一般的にDNA polymeraseは、誤って取り込んだ塩基のところで伸長をストップしてしまう性質があります。本酵素の場合、一般的にその活性が強い場合PCRの効率を低下させてしまうことの知られているProof-reading活性を欠失させたKOD(exo-)をベースとして、Proof-reading活性を有するKOD DNA polymeraseを微量混合することによって、誤って取り込んだ塩基を除去するため、PCRの効率が向上すると考えられています。よって、正確性はKOD DNA polymeraseと比べるとあまり良くありません。
＜ワンポイントアドバイス＞
●PCR産物のクローニング
基本的にどのような方法でもTAクローニング可能です。
高効率TAクローニングキットTArget CloneTMなどをご利用いただけます。
●コロニーダイレクトPCRに最適です。
高効率かつ迅速なPCRに向くため、コロニーダイレクトPCRに最適です。
また、コロニーダイレクトPCR用にプレミックスされたPCR試薬
InsertCheck -Ready- を用いることで、さらに簡便にコロニーダイレクトPCRを行うことができます。
●PCR条件の設定について
伸長反応は、ターゲット1kbに対して30sec.を標準とします。
「スメアリングが認められる場合」
伸長反応の時間を短くするか酵素量を減らして検討します。
「GC-richな鋳型等、高次構造を取りやすい鋳型の場合」
本酵素は耐熱性が高いため、、変性反応を96℃以上で行うことが可能です。
＜関連ページ＞
基本反応条件や他の実施例（酵素使用量、プライマー濃度、鋳型量、サイクル条件等の検討）は
コチラからご覧いただけます。
＜参考資料＞※PDFファイル
1. PCR Corner (UPLOAD Vol. 82) (2) コロニーダイレクトPCR
2. 私にもできた Vol 1 『PCRを用いる遺伝子クローニング編』
1) Imanaka T. et al., Appli. Environ. Microbiol., 60: 4559-4556 (1994)
2) Imanaka T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 63: 4504-4510 (1997)
3) Imanaka T. et al., J. Biotechnology, 88: 141-149 (2001)
4) Barnes W. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2216 (1994)
5) Kanzaki H. J. Bone and Mineral Res., 17: 210-220 (2002)
6) Nakayashiki H. et al., Genetics, 153: 693-703 (1999)
7) Kikuchi A. et al., Gene, 236: 293-301 (1999)
※製品名をクリックしていただくと取扱説明書をご覧いただけます。
| 品名 |
包装 |
輸送・
保存温度 |
Code No. |
価格 |
| KOD Dash |
250Units×1本
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-20℃
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LDP-101
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￥25,000 |
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(250U×１本)
×5本
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-20℃
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LDP-101X5
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￥100,000 |
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(250U×１本)
×10本
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-20℃
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LDP-101X10
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￥180,000 |
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KOD Dash FAQ
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高効率PCR酵素
