KOD -Plus-, KOD -Plus- Ver.2

正確性弊社No1!高正確性PCR酵素にありがちな「増えない」を解消。
広いターゲットに対して確実な増幅をお約束します！

本酵素は、鹿児島県小宝島の硫気孔より単離された超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1由来のKOD DNA polymeraseをベースに開発された高正確性
ＰＣＲ用酵素です。弊社PCR酵素の中で最高の正確性を示します。クローニング用酵素として最適です。

【関連製品】クルードサンプル等で高い成功率のPCR酵素「KOD FX」 はコチラからご覧いただけます。


特長１.　高い正確性
KOD -Plus- シリーズは、強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性（Proof-reading活性）を有し、高い正確性を示すKOD DNA polymeraseの最高水準の正確性をさらに向上させることに成功しました。その正確性はTaq DNA polymeraseの約80倍です。クローニングに最適です。

	Colony number		Mutation frequency (%)
	Total	Mutant
KOD -Plus-	10,610	10	0.09
A社 High fidelity PCR enzyme	10,900	68	0.62
Pfu based DNA polymerase	6,520	76	1.17
Taq DNA polymerase	10,560	780	7.39

　　　　　　　　　　　　　　　　図１：他社製品、他酵素との正確性の比較
　　　上記データはＰＣＲ fidelityは、rpsL遺伝子を用いたポジティブセレクション法に基づく
　　　　　　　　　　　　　　　ＰＣＲ産物の変異頻度解析により測定しました。

特長２.　ホットスタートでPCRパフォーマンス向上
2種類のモノクローナル抗体が混合することによって、非特異反応の原因となる
常温下でのPolymerase活性と3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を抑制しています。
抗体はPCRの最初のステップで失活し、増幅反応には影響を及ぼしません。

特長3.　伸長性・増幅効率向上
反応バッファー組成を至適化することにより、従来のKOD DNA polymeraseよりも
伸長性・増幅効率が向上しています。

特長4.　優れた耐熱性
Taq DNA Polymeraseよりも耐熱性が優れているため、変性ステップの温度を
高く設定することができ、GC-richな高次構造を形成するようなターゲットに有効です。

特長４.　高いPCR成功率【KOD -Plus- Ver.2】
増幅しにくいターゲットや長いターゲットに対するPCRの成功率が向上しています。
また、逆転写反応液の持込による阻害も低減されています。

＜参考資料＞

＜ワンポイントアドバイス＞
●PCR産物のクローニング
本酵素のPCR産物は平滑化されており、平滑末端クローニング法によってクローニングできます。その際ベクター側を脱リン酸化処理している場合、PCR産物のリン酸化を行うか、5'リン酸基のついたプライマーを使用する必要があります。　また、本酵素のPCR産物は平滑化されているため、直接TAクローニングすることはできません。専用のTAクローニングキット「TArget CloneTM-Plus-」をご使用ください。
 
●PCR条件の設定について
酵素の標準使用量は、50μlの系に対して1Uとしてください。伸長反応は、68℃で行い、ターゲット1kbに対して1min.を標準とします。スメアリングが起こっている場合はMgSO₄の濃度を下げ、増幅が見られない場合はMgSO₄濃度を上げて検討します。

●GC-richな鋳型の場合
反応液にDMSOを最終濃度2〜5%程度添加することにより、改善される場合があります。

●RT反応液を鋳型とする場合
RT反応液の大量の持ち込みは、本酵素によるPCR反応を阻害する場合があります。RT反応液のPCRへの持ち込みは、PCR反応液の1/25以下（好ましくは1/50以下）をお薦めします。この場合、RT反応液からのMg²⁺やdNTPsの持ち込みについては考慮する必要はなく、基本反応条件に沿って、本酵素の添付のdNTPsとMgSO₄を添加していただければ問題ありません。

＜ご注意＞
●プライマーの設計
3'側にミスマッチのあるプライマーは、本酵素によって校正を受ける場合があります。

一口メモ①ポリメラーゼについて
PCRに用いられるDNA polymeraseは大きく2種類に分けることができます。一つは、好熱細菌から分離されたpolI型と呼ばれるポリメラーゼで、TaqやTth　DNA polymeraseがこれにあたります。もう一つは、超好熱Archaeaから分離されたα型と呼ばれるポリメラーゼで、KOD やPfu DNA polymeraseがこれに相当します。α型酵素は、polI型酵素にない、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有しています。この活性は、Proof-reading活性とも呼ばれ、PCRの正確性に深く関与します。KOD DNA polymeraseはこのProof-reading活性が強く、大変高い正確性を示します。ただ、一般的にこの活性を有する酵素はPCRパフォーマンスが悪いと言われています。KOD -Plus-、及びKOD -Plus- Ver.2は、ホットスタート法、及びバッファー組成の改良によってPCR効率を向上させています。KOD -Plus- Ver.2は、KOD -Plus-の反応組成をさらに向上させることにより、PCRの成功率をさらに改良しています。

 一口メモ②　ホットスタートとは？
　PCR反応溶液を調製する作業を室温で行うと、調製工程においてもポリメラーゼが働いてしまいます。室温ではプライマーの特異性が低くなっているため、非特異反応の原因となる副反応が起こりやすくなることが知られています。また、KOD DNA polymeraseは強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性(Proof reading活性)を有しているため、その活性も副反応の大きな原因となります。ホットスタート法は高温になった段階でポリメラーゼが働くようにする方法で、今までいくつかの方法が考案されています。もっとも厳格にその制御を行う方法が中和抗体を用いる方法です。KOD -Plus-、およびKOD -Plus- Ver.2には2種類の抗KOD DNA polymerase抗体が混合されており、常温でのポリメラーゼ、及びProof-reading活性を完全にブロックします。このブロックは、PCRの最初の変性工程で抗体が完全に失活するため、PCRへの影響は全くありません。

基本反応条件等はコチラからご覧いただけます。 


1) Imanaka T. et al.,Appli Environ. Microbiol, 63: 4504-4510 (1997)
2) Thomas A. Kunkel.J. Biol. Chem., 260: 5787-5796 (1985)
3) Imanaka T. et al.,J. Biochem. (Tokyo), 125: 983-986 (1999)
4) Imanaka T. et al.,J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
5) Ohki Y. et al.,J. Biochem. (Tokyo), 132: 713-718 (2002)
6) Okuno K.. et al.,Biotchnol. Appi. Biochem., 36: 77-84 (2002)
7) Karaya K.. et al.,J. Biochem. (Tokyo), 129: 769-775 (2001)


（製品名をクリックしていただくと取扱説明書をご覧いただけます。）

※KOD-202は包装変更のためKOD-201X5に、KOD-203は本数変更のためKOD-201X10にそれぞれ変更となりました。

 KOD -Plus- / KOD -Plus- Ver.2 FAQ