ReverTra Ace^®

 

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M-MLV RTaseを改良　伸長性・反応効率・高温反応性がUP
ReverTra Ace^® は、M-MLV RTase遺伝子のRNaseH活性ドメインとDNA合成ドメインに
当社独自の点変異を導入し、機能改変した高性能逆転写酵素です。
今までにない高温反応性・伸長性・反応効率を実現しています。

RNaseH活性は、cDNA合成において鋳型/プライマーであるDNA-RNAハイブリッドのRNAを分解し、
反応効率等の低減の原因となることが知られていますが、本酵素ではその活性を低減しています。
また、RTaseの高温反応性の向上は、反応温度を上げることにより鋳型RNAの高次構造を緩和し、
RTaseによるcDNA合成反応を促進させることができます。
本酵素は、従来のデリーションタイプのM-MLV RTase RNaseH−に比べ約4倍の比活性を持ち、
高効率のRT-PCRを行うことができます。

※本酵素を使用したcDNA合成キットもございます。コチラからご覧いただけます。

特長1　伸長性が向上
M-MLV RTaseのRNaseH活性ドメインに、点変異を導入しRNaseH活性を除去。
従来のM-MLV RTase、デリーションタイプのM-MLV RTase RNaseH−に比べて、
伸長性が格段に向上しています。

特長2　反応効率・高温反応性が向上
M-MLV RTaseのDNA合成ドメインに点変異を導入することで、
高温反応性・反応効率が向上しています。

特長3　RT-PCRに最適
幅広いRT反応を行うことができ、特にRT-PCRに適しています。
リアルタイムPCRに最適です。


実施例1.  42〜60℃におけるcDNA合成反応
poly(rA) Tailを持つ9.49、7.46、4.40、2.37、1.35kbの長さのRNA 0.4μgを鋳型に42〜60℃の反応温度でoligo(dT)30 25pmolesをプライマーとして、酵素100Uを用いて30min.のcDNA合成反応を行いました。
ReverTra Ace^® では42℃及び50℃で9.49kb、55℃で4.4kb、60℃で2.37kbのcDNAの合成が確認されました。


実施例2.  cDNA合成効率の比較
in vitroで合成したG3PDHのRNA 10²〜10⁵copiesを鋳型にG3PDH下流側プライマーを用い、42℃、20min.にてcDNA合成反応を行った後、G3PDH上流側プライマーを加えrTaq DNA PolymeraseでPCRを行いました。
ReverTra Ace^® では10²copiesのRNAから行ったものについても増幅産物が確認されました。


実施例3.  14kbのcDNA合成反応
Human骨格筋poly(rA) RNAを鋳型に、ジストロフィンmRNAの3'側に特異的なcDNA合成用プライマーを作製し、42℃、30min.にてcDNA合成反応を行った後、mRNAの5'側に特異的なPCR用Primer Set（cDNA合成用プライマーより14kb上流）を作製し、KOD Dash^® でPCRを行いました。
その結果、ReverTra Ace^® を使用すれば、14kb以上の伸長が可能であることが示唆されました。



1μgのPoly A+ RNA鋳型を使用した場合の鋳型の利用効率を標識ヌクレオチドの取り込みで測定した結果、10Unit使用時で約25%、100U使用時で約40%と、高い値を示すことが分かっています。


●原理

●基本反応条件：コチラからご覧いただけます。


1）K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226（2003）
2）A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66（2002）
3）S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246（2002）
4）S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460（2001）
5）Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675（2000）
6）S.Lee et al.,Gene,245:253−266（2000）