KOD -Plus- Neo

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サイクル後半での増幅の鈍化を改善。伸長時間短縮(30 sec/kb)で理想的なクローニング用PCRを実現。

KOD DNA polymeraseは、強い3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を有し、正確にターゲット配列を増幅することができるため、クローニング用のPCR酵素として好評いただいております。しかし、高正確性PCR酵素は、20〜30サイクル以降、増幅が持続しなくなる<プラトー現象>が出やすいと言われています。KOD -Plus- Neoは、高正確性PCR酵素： KOD -Plus-シリーズの技術に、弊社で新たに開発した「伸長エンハンサー」を応用することでTaqの約80倍というKOD -Plus-シリーズの高い正確性を保持しつつ、<プラトー現象>を抑えることにより、微量な鋳型DNAからの増幅や長いターゲットの増幅効率を格段に向上させることに成功しました。

【関連製品】クルードサンプル等で高い成功率のPCR酵素「KOD FX」 はコチラからご覧いただけます。

最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いるプライマーのTm値計算表(EXCEL)は、こちらからダウンロードいただけます。

特長１.　微量な鋳型DNAから正確・高効率な増幅が可能
伸長エンハンサー技術を応用することによって、微量な鋳型DNAからでも高正確・高効率に目的遺伝子を増幅することができるようになりました。本酵素は高い正確性（Taqの約80倍）を示し、低コピー数の鋳型からも正確に目的遺伝子を増幅することができます。
また、抗体を用いるホットスタート法にも対応しており、特異性良く増幅することができます。




特長２.　伸長時間を短縮<30sec./kb>　（長いターゲットでより便利になりました）
伸長時間を、従来品の60sec./kbから30sec./1kbに短縮。長いターゲットでより便利になりました。


特長３.　様々なプライマーで同一温度サイクル条件を実現
反応バッファー組成を至適化することにより、従来のKOD DNA polymeraseよりも伸長性・増幅効率が向上しています。
検討不要のサイクル条件を実現しました。20mer以上のプライマー(Tm値>63℃)においては、まずは2ステップサイクルをお試しください。検討要らずで簡単です。
*Tm値は最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いて計算した値を利用しています。


特長４.　長鎖ターゲットの増幅
伸長性が向上しました。様々な長さのターゲットを増幅できます。ゲノムDNAで24kbまでの増幅を確認しています。

実施例1. Total RNA からの様々な遺伝子の全長ORFの増幅
実施例2. 微量Templateからの増幅
実施例3. 様々なサイズのターゲットにおける増幅効率･伸長性の比較



＜ワンポイントアドバイス＞
●PCR産物のクローニング
本酵素のPCR産物は平滑化されており、平滑末端クローニング法によってクローニングできます。その際ベクター側を脱リン酸化処理している場合、PCR産物のリン酸化を行うか、5'リン酸基のついたプライマーを使用する必要があります。　また、本酵素のPCR産物は平滑化されているため、直接TAクローニングすることはできません。以下の手法を用いる専用のTAクローニングキット「TArget Clone(TM) -Plus-」をご使用ください。

*TArget Clone -Plus-(Code No. TAK-201）に含まれています。
**Ligation high Ver.2 (Code No. LGK-201)を推奨いたします。


＜ご注意＞
●プライマーの設計
3'側にミスマッチのあるプライマーは、本酵素によって校正を受ける場合があります。

一口メモ①ポリメラーゼについて
PCRに用いられるDNA polymeraseは大きく2種類に分けることができます。一つは、好熱細菌から分離されたpolI型と呼ばれるポリメラーゼで、TaqやTth　DNA polymeraseがこれにあたります。もう一つは、超好熱Archaeaから分離されたα型と呼ばれるポリメラーゼで、KOD やPfu DNA polymeraseがこれに相当します。α型酵素は、polI型酵素にない、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有しています。この活性は、Proof-reading活性とも呼ばれ、PCRの正確性に深く関与します。KOD DNA polymeraseはこのProof-reading活性が強く、大変高い正確性を示します。ただ、一般的にこの活性を有する酵素はPCRパフォーマンスが悪いと言われています。KOD -Plus- Neoは、新規伸長エンハンサーの応用、ホットスタート法、及びバッファー組成の改良によってPCR効率を向上させています。

 一口メモ②　ホットスタートとは？
　PCR反応溶液を調製する作業を室温で行うと、調製工程においてもポリメラーゼが働いてしまいます。室温ではプライマーの特異性が低くなっているため、非特異反応の原因となる副反応が起こりやすくなることが知られています。また、KOD DNA polymeraseは強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性(Proof reading活性)を有しているため、その活性も副反応の大きな原因となります。ホットスタート法は高温になった段階でポリメラーゼが働くようにする方法で、今までいくつかの方法が考案されています。もっとも厳格にその制御を行う方法が中和抗体を用いる方法です。KOD -Plus- Neoには2種類の抗KOD DNA polymerase抗体が混合されており、常温でのポリメラーゼ、及びProof-reading活性を完全にブロックします。このブロックは、PCRの最初の変性工程で抗体が完全に失活するため、PCRへの影響は全くありません。



1）M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63: 4504−4510（1997）
2）H. Hashimoto et al., J. Biochem.（Tokyo）,125: 983−986（1999)
3）H. Mizuguchi et al., J. Biochem.（Tokyo）,126: 762−768（1999）
4）M. Nishioka et al., J. Biotechnol. 88, 141-149 (2001).
5) H. Hashimoto et al., J. Mol. Biol.,306: 469−477（2001）
6）T. Imanaka, et al. J. Chin. Inst. Chem. Engrs., 32, 277-288 (2001)



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