Blunting high

短時間で効率的なDNA平滑化とライゲーションが可能です
　
本キットはDNA末端の平滑化（ブランティング：blunting）とそれに続くライゲーションを行うキットです。DNA末端の平滑化に使用するKOD DNA Polymeraseは、超好熱始原菌Thermococcus属由来の耐熱性DNA Polymeraseです。本酵素は、Polymerase活性と3'→5'Exonuclease活性を持ち、dNTPsの存在下で5'突出末端のfill in、3'突出末端のtrimを行うため、DNA末端を効率良く平滑化することが可能です。
また、ライゲーション試薬「Ligation high」はプレミックスタイプであり、DNA溶液に混合するだけで、迅速に高効率のライゲーションが可能です。
本キットを用いることで、簡便で効率の良い平滑末端ライゲーションを実現することができます。

特長1　迅速
速いDNA合成速度と強い3'→5'Exonuclease活性を持つKOD DNA Polymeraseを使用しています。短時間の反応（2分）で、DNAの完全平滑化が可能です。

特長2　簡便
キットにはプレミックスタイプのLigation highを添付。平滑反応後、簡便な操作で、高効率の平滑末端ライゲーションが可能です。

 1.ベクターの平滑化例

ブランティング処理の有無による形質転換効率の比較を行いました。
EcoRⅠ(5'端突出)とSphⅠ(3'端突出)でDouble digestionしたpUC18 DNAをBlunting highを用いて、平滑化、及びLigationを行った後、反応液を用いて、大腸菌を形質転換しました。未切断のpUC18により得られた形質転換効率を100％としてグラフにしたのが右図です。図より、突出末端を持つpUC18が、本キットによって効率よく平滑末端ライゲーションされたことが分かります。

●形質転換への適応
ライゲーション反応後、サンプルをエレクトロポーレーションに使用する場合には、エタノール沈殿やキットなどで脱塩操作が必要である。

●ライゲーション反応について
Ligation highの反応は、16℃、60分間行うことを薦める。平滑化反応液のライゲーション反応液への持ち込みが多くなると効率が低下する原因となる。その時には、ライゲーションの時間を長くするか、平滑化反応後エタノール沈殿などでTEバッファーに置換すると良い。

●ご注意
本キットの10×Blunting Bufferは、KOD DNA Polymeraseに添付されているBufferとは組成が異なります。



＜製品内容＞
KOD DNA Polymerase（2.5U/μl） 20μl
10×Blunting Buffer 100μl
Ligation high* 375μl
Control DNA（10ng/μl） 50μl

*安定剤として使用してるBSAが、沈殿を形成する場合がありますが、そのまま用いても効率には影響はありません。

＜基本反応条件＞
1.平滑化
DNAサンプル Xμl
10×Blunting Buffer 1μl
KOD DNA Polymerase 1μl
-----------------------------
Total Volume 10μl　　　→72℃、2min.

2.ライゲーション
平滑化DNAサンプル Yμl
Ligation high 10μl
-----------------------------
Total Volume 20μl　　　→16℃、60min.

1）Y.Katsuyama et al.,Develop, Biol.,213:257−268（1999）

(品名をクリックすることで、取扱い説明書をダウンロードいただけます）

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【FAQ】
Blunting high

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