Ligation high Ver.2

 

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TAクローニングの効率が飛躍的にUPしました。
-20℃保存で凍結せず、便利にお使いいただけます。

実施例追加しました！コチラからご覧いただけます。

　　　　　　　　　
本試薬は、弊社ライゲーション試薬『Ligation high』を更に使いやすく改良した高効率な1液タイプのライゲーション試薬です。本試薬は、右図のように-20℃でも凍結しません。フリーザーから取り出してすぐにご使用いただけます。使用方法は、従来品同様、DNAサンプル量のと1/2〜等量を混ぜるだけで簡便です。突出末端、平滑末端、及びTAクローニングに幅広くご使用いただけます。




特長１.　高効率
TAクローニングの効率が大幅にアップしました。
多くの場合、30分以内の反応でも十分な数のポジコロニーを取得可能です*。（実施例１参照）
*標準プロトコールでは反応時間を30分に設定しています。

特長2.　-20℃保存で凍結しません
フリーザーから取り出してすぐにご使用いただけます。

特長3.　便利な1液タイプ
使い方は、従来品同様、DNA断片と混合するだけで簡単です。

実施例1. TAクローニング効率比較
Tベクター<50ng>にλDNAの0.5kbPCR増幅断片(Taq DNA polymeraseで増幅後精製)をモル比で1:3となるように混合し、16℃で30分間ライゲーション反応を行いました。その後、Competent cell DH5αを形質転換してプレーティングし、翌日、白コロニー数（インサートあり）と青コロニー数をカウントしました。下図は、Ligation high Ver.2を用いたときに出現したコロニー数を100として換算し、比較したデータです。結果、Ligation high Ver.2を用いることで高効率にTAクローニングが可能になることが明らかとなりました。


実施例2. DNA末端の形状とライゲーション効率との関係
16℃反応における、DNA断片（0.5kb）のクローニング効率を末端形状別に比較しました。その結果、突出末端ライゲーションでは約5分でほぼライゲーション反応が完了していることが分かりました。また、平滑末端、及びTAクローニングにおいても30分で約70〜80%の反応が完了することが分かりました。　また、平滑末端クローニング、及びTAクローニングにおいては、1時間を越えて2時間まで徐々に効率が増加することも分かっており、クローニング効率が低い場合は、反応時間を2時間まで延長することにより、さらに効率を向上させることが可能です。
※各反応の60分後の白コロニー数を100として表示しています。


実施例3. 未精製PCR産物を用いるTAクローニング
Tベクター（50ng, 25fmol）と良好な増幅を示した未精製PCR産物（Taq DNA polymeraseで増幅した0.5kb断片）を様々な比率で混合したDNA溶液〈7.5μl〉に、Ligation high Ver.2〈7.5μl〉を添加し、16℃で30分間反応しました。その後、反応液10μlを用いてE. coli DH5αコンピテントセル〈100μl〉を形質転換し、LB/Amp（X-Gal）プレートで培養後、コロニー数をカウントしました。その結果、なるべくPCR反応液の持ち込み量を少なくした方が良好な結果が得られることが分かりました。　また、精製したDNA断片を用いた方が高い効率が得られることが分かっており、効率が低い場合は、精製PCR産物を用いる方が良好な結果が期待できます。


＜反応条件＞
各用途別の反応条件等に関してましては、取扱説明書に詳細をご紹介しております。

 
＜ご注意＞
1.−30℃以下の温度で長期間保存した場合や、冷凍庫内の冷気の噴出口近くなどに保存した場合、凍結する可能性があります。5回までの凍結融解実験により活性が低下しないことを確認していますが、できるだけ凍らせないようにご注意願います。凍結した場合は、チューブを指の腹でつまんで、液温が高くならないように注意しながら融解します。
2.白濁がみられた場合にも同様に溶解することにより通常通りご使用いただけます。
3.凍結する可能性がある場合は、予め小分け分注して保存することをお薦めいたします。


＜ワンポイントアドバイス＞
●反応時間について
基本的に16℃、30分間を推奨しますが、一般的な突出末端のライゲーションは5分程度で完了します。また、平滑末端やTAクローニングで効率が低い場合は、2時間を目安に反応時間を延長することで更に効率を向上させることができます。

●反応液の持込について
塩の持込はライゲーション反応に影響を及ぼします。TAクローニングに関しても、未精製PCR産物の持ち込みは0.5〜1μl（15μl反応）とした方が高い効率を得ることができます。また、MagExtractor^TM -PCR & Gel Clean upなどを用いて精製を行うことにより、更に高い効率でTAクローニングを行うことが可能です。

●TAクローニングの効率について
更に、効率を向上させたい場合は、リン酸化したプライマーを用いてPCRを行うことにより効率を向上させることができます。プライマーのリン酸化法はコチラからご覧いただけます。


1）Richard L. Hawkins et al.,Current Microbiol.,38:335−341（1999）

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（品名をクリックしていただくと、詳細をご覧いただけます）

【FAQ】
Ligation high Ver.2

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