東洋紡ライフサイエンス事業部
実施例 抗体アッセイ
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ウエスタンブロット解析

ウェスタンブロット解析は、様々な蛋白質を特異的に検出する手法として、蛋白質研究分野において欠くことのできない技術です。ウェスタンブロット解析は、抗体を用いて抗原抗体反応で検出する実験手法ですが、シグナルが弱い、バックグラウンドが高い、非特異的なバンドが検出されるなど思ったような結果が得られず悩んでおられるユーザー様も多いようです。弊社のCan Get Signal®  Immunoreaction Enhancer Solution[以下Can Get Signal® ]は抗原抗体反応を適正に促進する働きを持つバッファーであり、使用方法は現在お使いのTBS-Tやブロッキング溶液などの代わりに抗体希釈液として使用するだけで大変簡便です。本試薬はシグナルの増強効果やバックグラウンドの低減効果が高く、既にウェスタンブロット解析の標準プロトコールとして採用いただいている研究室も多いようです。

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また、Can Get Signal® を用いるプロトコールを中心に、ウェスタンブロット解析の注意点について解説いたします。
200804287-3-02.jpg(1)抗体量について
 過剰量の抗体はバックグラウンドの原因になります。特に、Can Get Signal® をお使いの場合は通常よりも少ない抗体量でも十分なシグナルが得られることが多く、抗体濃度には注意が必要です。
 右の結果は、His-ERK2タンパク質のウェスタンブロットによる検出結果(抗His-tag抗体使用)を示しています。従来法(1次抗体濃度1:1000)では、特異的なバンドの出現は認められますが、バックグラウ
ンドが高く、非特異バンドやマーカーへの強い非特異反応もみられます(図1)。一方、Can Get Signal® (1次抗体濃度1:5000)使用時は、抗体濃度は従来法に比べて1/5ですが、シグナルは同等レベルであり、非特異バンドは明らかに軽減されていることがわかります。
 また、発現量の多い抗原をサンプルとして用いた場合、発光法での検出においてバンドが白く抜けたようになることがあります。この原因は、目的バンドに過剰に濃縮された標識抗体のペルオキシダーゼによって発光用の基質が検出を行う前にほとんど消費されてしまうためです。そのような場合は、泳動するサンプル量を減らすとともに、使用する抗体の量も抑えるような対策が必要となります。

(2)ブロッキングについて
Can Get Signal® を用いる場合もブロッキングのステップは必要です。ブロッキング剤の種類によっては、 検出感度やバックグラウンドが改善されることもありますので、良い結果が得られないときはブロッキング剤の種類を検討することも有効です。また、リン酸化タンパク質を検出する場合は、カゼインなどのリン酸化タンパク質を多く含むブロッキング剤は避るような配慮も必要です。
 ここでは、5%スキムミルク/TBS-Tと5%BSA/TBS-Tを用いた例を示します。下図左のEGFRを検出した例では、5%スキムミルク/TBS-Tを用いた方が明らかに非特異バンドが軽減されているのが分かります(図2)。また、下図右のActinを検出した例では、5%BSA/TBS-Tでブロッキングした方が高い感度で検出することができています(図3)。
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